檸檬酸(Citric Acid, CA),又稱枸櫞酸,是一種重要的有機(jī)酸,在自然界中分布很廣,天然的檸檬酸存在于植物如檸檬、柑橘、菠蘿等果實(shí)和動(dòng)物的骨骼、肌肉、血液中。很多種水果和蔬菜,尤其是柑橘屬的水果中都含有較多的檸檬酸,特別是檸檬和青檸含有大量檸檬酸。
目前,可采用分光光度法檢測(cè)檸檬酸(CA)的含量。
分光光度法是基于物質(zhì)對(duì)光的吸收特性進(jìn)行的。當(dāng)光線穿過(guò)物質(zhì)時(shí),會(huì)被物質(zhì)吸收,且吸收程度與物質(zhì)的濃度成正比。因此,通過(guò)測(cè)量光線通過(guò)物質(zhì)時(shí)的吸光度,可以確定物質(zhì)的濃度。在 CA 含量檢測(cè)中,常用的分光光度法包括比色法、吸光光度法等。
一、樣品中檸檬酸提取:
a. 液體樣品中檸檬酸提取:取 0.1mL 液體加試劑一 0.9mL,充分混勻,11000g/min 4℃離心 10min, 取上清液,待測(cè)。
b. 組織中檸檬酸提取:稱約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一,冰上充分研磨,11000g/min 4℃離心 10min,取上清液,待測(cè)。
c. 線粒體中檸檬酸提取:稱約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一,冰上充分研磨,600g/min,4℃離心5min;取上清至另一 EP 管中,11000g/min,4℃離心 10min,棄上清(此上清液可用于細(xì)胞質(zhì)CA 含量測(cè)定);向沉淀中加試劑二 200µL,以及試劑三 2µL,充分懸浮溶解,11000g/min,4℃離心 10min,取上清液,待測(cè)。
二、測(cè)定:
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 545 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑一置于 30℃水浴中預(yù)熱 30min 以上。
3. 按下圖在 1.5mLEP 管中加入相應(yīng)試劑
試劑名稱(µL) | 空白管 | 測(cè)定管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 |
蒸餾水 | 100 | ||
上清液 | 100 | ||
標(biāo)準(zhǔn)品 | 100 | ||
試劑一 | 700 | ||
試劑四 | 100 | ||
試劑五 | 100 | ||
充分混勻后室溫靜置 30min,于 545nm 測(cè)定吸光度,記為 A 空白管、A 測(cè)定管、A 標(biāo)準(zhǔn)管。 |